Las estadounidenses fueron superadas por las checas por 7-5 (7/5) y 6-4 en la pista central de Flushing Meadows (Nueva York), en una atmósfera menos intensa que en los partidos de esta semana de Serena.
La eliminación permite a Serena Williams concentrarse en la competencia individual del US Open, que retomará el viernes ante la australiana Ajla Tomljanovic, número 46º del ranking mundial, por un lugar en los octavos de final.
Las Williams, cuyo último triunfo se remonta a 2016 en Wimbledon, anunciaron su regreso como pareja cuando existían muchas incógnitas sobre el recorrido que podría hacer Serena en su posible último torneo.
Pero tras dos asombrosas victorias de Serena ante Danka Kovinic y Anett Kontaveit, segunda del ranking mundial, la duda pasó a ser si el esfuerzo en los dobles le pasaría factura.
A sus casi 41 años, Serena ha anunciado que está en la cuenta atrás de su carrera pero se resiste a confirmar si la despedida ocurrirá en este Grand Slam.
Venus, de 42 años, fue eliminada en la primera ronda y aún no ha aclarado hasta cuándo seguirá compitiendo.
"Aún estoy en shock"
La noche del jueves, las Williams fueron recibidas con una enorme ovación en la pista Arthur Ashe, la mayor del mundo (23 mil 800 espectadores), pero sin los homenajes ni el desfile de celebridades que acompañaron esta semana a Serena.
Frente a la veterana Hradecka, de 37 años, y la promesa Noskova, de 17 años, las estadounidenses arrancaron con una ventaja de 4-5 y dos pelotas de set que no pudieron concretar.
Las checas salvaron la situación y volvieron a levantar una desventaja de 4-5 en el 'tiebreak' para poner un set de distancia ante la decepción del público estadounidense.
Serena mostraba destellos de sus asombrosas actuaciones individuales de esta semana y animaba a cada oportunidad a Venus, más errática.
Sin la tensión de que pudiera ser el fin de la carrera de Serena Williams, ganadora de 23 títulos de Grand Slam, el público de la central fue digiriendo la cercana derrota cuando las checas se adelantaron 3-0 en el segundo set.
Pero delante tenían a las Williams, las guerreras forjadas en las calles de Compton, y no se iban a rendir sin plantar batalla.
Las estadounidenses rompieron de vuelta el servicio para empatar 4-4 y, con el público conectado de nuevo, estuvieron a un punto de quebrar y ponerse en la antesala del empate.
Hradecka y Noskova arruinaron esta vez la gesta en la Arthur Ashe y finiquitaron la eliminación de las ídolos locales.
Nada más consumarse la derrota, las hermanas abandonaron la pista en medio de una gran ovación de sus aficionados dejando el protagonismo a las vencedoras.
"Todavía estoy en shock por haber ganado, porque es la primera vez que jugamos juntas", dijo Hradecka. "Lo siento mucho por ustedes que las hayamos ganado, pero estamos muy contentas de haberlo hecho".